تثبيت (هستولوجيا)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
التثبيت وأنواع المثبتات
تهدف عمليات التثبيت fixation إلى القتل السريع والمفاجئ للخلايا مع المحافظة قدر الإمكان على بنيتها الطبيعية التي كانت عليها قبل القتل. ويتم التثبيت إما فيزيائياً أو كيميائياً.
- فيزيائياً: باستعمال الحرارة والبرودة والتجفيف (التجفيف بالتبريد)
- كيميائياً: باستعمال المواد الكيميائية التي تدخل في تركيب المثبتات المختلفة
المستهدف والمثبت الكيميائي المرغوب وغير المرغوب
| الهدف | المثبتات المرغوبة | مثبتات يجب تجنبها |
|---|---|---|
| پروتينات | Neutral Buffered Formalin, Parafomaldehyde | Osmium Tetroxide |
| إنزيمات | Frozen Sections | Chemical Fixatives |
| الدهون | Frozen Sections*, Glutaraldehyde/Osmium Tetroxide | Alcoholic fixatives, Neutral Buffered Formalin |
| الأحماض النووية | Alcoholic fixatives, HOPE | Aldehyde fixatives |
| Mucopolysaccharides | Frozen Sections | Chemical fixatives |
| Biogenic Amines | Bouin's~, Neutral Buffered Formalin | |
| گلايكوجن | Alcoholic based fixatives | Osmium Tetroxide |
- Frozen Sections preserve RNA and Lipids despite poor morphology. Compare to Paraffin sections, synonymous to Chemical Fixatives in the table, which destroy RNA and affect some antigens BUT give good morphology.
~ A picrate
المثبتات الأكثر استعمالاً
- خليط حمض الخل والكحول
حمض الخل الثلجي 10 مل ml
كحول مطلق 30 مل ml
- مثبت بوين bouin (للنواة)
محلول مائي مشبع من حمض الكبريت (المر) 15 مل ml
فورمول أو فورم ألدهيد تركيز 40% 5 مل ml
حمض الخل الثلجي 1 مل ml
- مثبت بوين الكحولي
حمض البكريك 1 غ g
فورمول أو فورم ألدهيد 40% 60 مل ml
حمض الخل الثلجي 15 مل ml
كحول 80% 150 مل ml
- مثبت كاروني carnay (للنواة)
حمض الخل الثلجي 10 مل ml
كحول مطلق 60 مل ml
كلوروفورم 30 مل ml
- مثبت فلمنغ flenming قوي التأثير (للنواة)
محض الكروم (محلول مائي 1%) 15 مل ml
رابع أوكسيد الأسميوم (محلول مائي من oso تركيزه 2%) 4 مل ml
حمض الخل الثلجي (يضاف قبل الاستعمال) 1 مل ml
- مثبت فلمنغ flenming ضعيف التأثير (للنواة أيضاً)
حض الكروم (محلول مائي 1%) 125 مل ml
رابع أوكسيد الأسميوم (محلول مائي 2%) 100 مل ml
ماء مقطر 775 مل ml
- مثبت شامبي champy
ثاني كرومات البوتاسيوم (محلول مائي 3%) 7 مل ml
حمض الكروم (محلول مائي 1%) 7 مل ml
رابع أوكسيد الأسميوم (محلول مائي 2%) 4 مل ml
- مثبت حمض الكروم وحمض الآزوت
حمض الآزوت 10% 40 مل ml
كحول مطلق 30 مل ml
حمض الكروم 0.5% 30 مل ml من محلول مائي
- مثبت مزيج (كحول-خل-فورمول) (F.A.A)
كحول 95% 15 مل ml
فورم ألدهيد 40% 6 مل ml
حمض الخل 1 مل ml
ماء مقطر 30 مل ml
- مثبت ريغورد regaud (للسيتوبلاسما الكوندريوم)
ثنائي كرومات البوتاسيوم (محلول مائي 3%) 80 مل ml
فورم ألدهيد أو فورمول 20 مل ml
- مثبت هيلي helly
كبريتات الصوديوم 1 غ g
ثنائي كرومات البوتاسيوم (محلول مائي 3%) 50 مل ml
كلور القصدير (محلول مائي مشبع) 50 مل ml
فورم ألدهيد 40% (يضاف قبل الاستعمال) 5 مل ml
- مثبت سوسا sawsa:
كلور القصدير 45 غ g
كلور الصوديوم 5 غ g
حمض ثلاثي كلور الخل 20 مل ml
حمض الخل الثلجي 40 مل ml
فورم ألدهيد 40% 200 مل ml
ماء مقطر 800 مل ml
إزالة المثبت ونزع الماء والترويق clearing
تجري إزالة المثبت بغسل الأعضاء النباتية بعد عملية التثبيت بطرق تختلف باختلاف المثبت المستعمل. وبهذا يمكن حفظها في تركيز 70% كحول ويستحسن إضافة 5% غليسيرين إذا حفظت لمدة طويلة قبل إزالة الماء, وهنا لابد من غسل العينة جيداً لإزالة الغليسيرين قبل عملية إزالة الماء التي تتم بتوضع العينات في تراكيز متصاعدة من الكحول الإيتيلي تبدأ من 5%, 10%, 20%, 30%, حتى 100% أو الأسيتون أو الكحول الميثيلي.
أما الترويق فإنه يهدف لجعل الأعضاء النباتية شفافة ويتم بواسطة هيدروكربون مناسب مثل اكزيلول.
طرق حفظ العينات
ويقصد بها الطرق التي تستعمل لحظ النباتات المراد دراستها مخبرياً وبخاصة فإننا قد لا نجد في الطبيعة جميع الأعضاء النباتية التي ينبغي دراستها في جميع فصول السنة مما يضطرنا لحفظها في سوائل خاصة تمنعها من التعفن والفساد.
تختلف طرق حفظ النباتات الراقية عن طرق حفظ الفطريات والطحالب.
بينما تحفظ الطحالب في محاليل خاصة تتصف بإبقائها على اليخضور وذلك بوضعها مباشرة في الماء المضاف له الفورمول بنسبة 5% (حجم الفورمول +19 من حجم الماء).
يجب استعمال ماء البحر للطحالب البحرية والماء العادي لطحالب المياه العذبة والتربة.
ويستعمل عادة لحفظ الطحالب المحلول التالي: ماء مقطر 100 سم cm
كافور 0.1 غ g
خلات النحاس 0.4 غ g
فورمول 4 سم cm
ونظراً لأن استعمال الفورمول التجاري يؤدي إلى انخفاض pH الوسط فإنه من المفضل إضافة (20 غ g) من البوراكس (بورات أو كربونات الصوديوم) لكل ليتر l من الفورمول.